1.以检测HIV为例说明Western印迹

　　分析：考查要点：Western印迹法。常见错误：步骤回答错误。从原理、用途、步骤等方面来回答

　　答案：免疫印迹法(Western blotting)又称Western印迹法。它将凝胶电泳与固相免疫结合，把电泳分区的蛋白质转移至固相载体，再用酶免疫、放射免疫等技术测定。该法能分离分子大小不同的蛋白质并确定其分子量，常用于检测多种病毒的抗体或抗原。例如，该法检测血清HIV抗体为HIV感染的确诊实验之一。第一步将HIV用离子去污剂十二烷基硫酸钠(SDS)裂解病毒结构蛋白，然后用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)将分子大小不同的蛋白质分开，这一方法简称SDS—PAGE。第二步，将电泳分离的病毒蛋白质转印到硝酸纤维素膜上(电转印法)。第三步，将硝酸纤维素膜浸于待检血清中，若血清含HIV抗体，即与膜上的相应病毒蛋白抗原结合，洗涤去除未结合的抗体，再加酶标记的二抗，最后加底物显色。

　　2.T细胞增生试验的方法。

　　分析：考查要点：T细胞增生试验常用方法及原理。常见错误：方法回答不全。T细胞增殖试验的方法有两种，即MTT法和3H—TdR参人法。

　　答案：T细胞增殖试验：植物血凝素(PHA)、刀豆蛋白A(Con A)等丝裂原以及抗CD3单克隆抗体等能非特异地激活培养的T细胞，使其转化为淋巴母细胞。在增生过程中细胞DNA、RNA、蛋白质的合成增加，细胞形态改变，最终细胞分裂。

　　(1) 3H—TdR参人法 在PBMC中，加入PHA共同培养，终止培养前8-15小时，加入氚标记的胸腺嘧啶核苷(3H—TdR)，由于3H—TdR能参人细胞合成的DNA中，细胞增生水平越高，参入的放射性核素越多。培养结束后收集细胞，用液体闪烁仪测定样品的β射线放射活性，反映细胞的增殖状况。该法灵敏可靠，应用广泛，但需特殊仪器，易有放射性污染。

　　(2)MTF法 MTF是一种噻唑盐，化学名3—(4，5—二甲基—2—噻唑)—2，5—二苯基溴化四唑。在细胞培养终止前数小时加入的MTF，作为细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶的底物参与反应，形成褐色的甲躜颗粒，并沉积于细胞内或细胞周围。甲躜可被随后加入的盐酸异丙醇或二甲基亚砜完全溶解，可用酶标测定仪测定细胞培养物的OD值。因甲躜的生成量与细胞增生水平正相关，故可用样品的OD值反映细胞增生水平的高低。该法也用于某些细胞因子活性的测定(细胞因子依赖的细胞株增生法)。MTF法敏感性虽不及3H—TdR参入法，但操作简便，无放射性污染。

　　T细胞增生试验也可检测特异抗原致敏的T细胞，在培养细胞中加入特异性抗原，则只有该抗原特异的T细胞发生增殖反应，从而反映机体特异的细胞免疫功能。

　3.什么是直接凝集反应，什么是间接凝集反应，各举一例说明其应用

　　分析：考查要点：凝集反应。常见错误：间接凝集原理回答错误。将可溶性抗原包被到乳胶颗粒等表面与相应抗体结合即间接凝集。

　　答案：表面带有抗原的不溶性颗粒(细菌、红细胞或乳胶颗粒)呈混悬状态存在，当加入相应抗体，若比例合适，即可出现抗原与抗体交联而成粗大不匀的凝集团块，即为凝集反应。细菌或红细胞表面的抗原成分与抗体结合出现细菌凝集或红细胞凝集即为直接凝集，可用于鉴定细菌或血型。

　　如果将可溶性抗原(病毒抗原、激素、甲状腺球蛋白)人为地包被到乳胶颗粒或红细胞表面，与相应的抗体混合出现凝集现象，称为间接凝集反应，此法可用于测定血液中的生长激素，尿中的绒毛膜促性激素及乙肝病毒表面抗原等。

　　4.试比较三大标记技术(荧光、放射、酶标记)异同、优缺点、应用。

　　分析：考查要点：免疫标记技术。常见错误：漏答不同点、仪器及用途。注意从相同点、不同点，原理、仪器及用途几方面回答。

　　答案：免疫标记检测技术的共同特点：①用标记抗体(或抗原)检测，仍保留抗体(或抗原)的特异性，且提高了抗原抗体反应检出的敏感性;②将标记物加入反应体系中，使发生抗原抗体反应后，应将未结合的标记抗体(或抗原)从反应系统中洗除去;③洗去游离标记物后，检测抗原—抗体复合物中标记物的多少来判断结果。或以测定洗出的未结合的标记物多少来判断结果。依不同试验条件而定。

　　各种方法的不同点及应用：

　　(1)免疫荧光法 将荧光染料与抗体分子进行化学联接，即为荧光标记抗体，用此荧光抗体去染组织或带特异抗原的细胞，对相应抗原进行定量或定位检查，可有直接荧光法和间接荧光法，后者更常用且灵敏度高，也可用双重荧光检测，即一种抗体标记异硫氰荧光素(黄绿色)，另一种抗体用藻红蛋白荧光色素标记(红色)，可同时检测两种不同抗原，如用单克隆抗体检测T细胞的亚类，免疫荧光法需用特殊的荧光显微镜，或检出仪器如FACS。

　　(2)放射免疫法 根据竞争性结合的原理。定量的放射性同位素标记抗原与未标记抗原竞争结合定量的抗体。未标记的抗原加入越多，与抗体结合的标记的抗原越少，也就是未结合的标记抗原越多。在用活性炭或滑石粉吸附去除全部未与抗体结合的游离抗原，就可定量测定放射性核素标记的免疫复合物。如测血液中胰岛素含量，在胰岛素抗体和已知量的核素标记胰岛素的混合液中加入待检样品，最后测沉淀物中核素的含量，如果待检样品中含胰岛素量越大，则沉淀物上含放射性核素量越少。放射免疫法极为敏感，多用于检测激素(胰岛素、甲状腺素、醛固酮等)或蛋白质(甲胎蛋白，IgE、乙肝表面抗原)、维生素、药物、酶等。此法试剂昂贵，有放射性污染。

　(3)酶标免疫法 某些酶可使底物产生颜色变化，将此酶与抗原或抗体联接，不影响各自原有的生物活性而制备出酶标抗原或抗体，用它来检测抗原或抗体即为酶免疫法。此法简便、快速、灵敏度高、应用广泛。常用的EHSA法有：双抗体夹心法用于测抗原，先将特异抗体包被塑料板，再加入抗原的待检标本，让抗原与固相载体表面包被的抗体结合，洗出未结合的材料，再加入抗同一抗原的酶标记抗体，再洗去未结合的酶标抗体，加底物显色，用ELISA仪器检测颜色光密度，作定量检测，光密度越高，待检样品中含有抗原量越高。

　　5.说明常用的沉淀试验原理并举一例说明其应用

　　分析：考查要点：沉淀反应。常见错误：内容有遗漏。常用的沉淀试验有以下几种。分别为单扩、双扩、免疫电泳及免疫印迹。

　　• 答案：可溶性抗原与相应抗体结合，在比例合适的情况下，可形成较大的不溶性免疫复合物，在反应体系中，呈现为不透明的沉淀，或引起光线散射现象，即为抗原抗体反应的沉淀现象，下述几种反应即是属于沉淀反应的几种方式。

　　(1)双向免疫扩散 在琼脂凝胶中的一定距离打孔分别放人抗原，抗体，当抗原和抗体向孔四周凝胶中扩散，在一定部位相遇形成沉淀线。可用于对抗体或抗原的定性检测，或判断两种抗原成分的相关性。

　　(2)免疫电泳 可对含有多种抗原的材料进行抗原种类分析，即先将抗原材料进行电泳分离，再与相应抗体进行双向免疫扩散，此法常用于血清蛋白种类分析，对于免疫球蛋白缺损(低下)或增多的疾病有重要诊断意义。

　　(3)单向免疫扩散 将抗体与琼脂凝胶混合制成凝胶板，将可溶性抗原材料加入到凝胶板的小孔里，抗原由小孔向四周凝胶中扩散，与琼脂中抗体相遇形成沉淀圈，加入抗原浓度与形成的沉淀圈直径成正相关。此法常用于定量测定血清中IgG、IgA、IgM、C3各成分。

　　(4)免疫印迹法 这是一种将免疫电泳与标记抗体技术相结合的检测技术，可用于检测样品中某种特异抗原的分子量。此法是先将抗原和分子量标准品在凝胶中电泳，将各成分按分子量大小依次分开，经印迹转移到硝酸纤维素膜上，用酶标抗体溶液浸泡上述硝酸纤维素膜，使抗体与膜上的抗原结合，再用底物显色，确定抗原位置即可得知其分子量。用此法可测定HⅣ(病毒)包膜抗原。