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化学发光免疫分析技术

　　第一节　概述

　　发光是指分子或原子中的电子吸收能量后，由基态(较低能级)跃迁到激发态(较高能级)，然后再返回到基态，并释放光子的过程。根据形成激发态分子的能量来源不同可分为光照发光、生物发光、化学发光等。

　　光照发光是指发光剂(荧光素)经短波长的入射光照射后，电子吸收能量跃迁到激发态，在其回复至基态时，发射出较长波长的可见光(荧光)。

　　生物发光是指发生在生物体内的发光现象，如萤火虫的发光，反应底物为萤火虫荧光素。实际上，生物发光就是发生在生物体内的一种化学发光。

　　一、化学发光

　　化学发光是指伴随化学反应过程所产生的光的发射现象。某些物质(发光剂)在化学反应时，吸收了反应过程中所产生的化学能，使反应的产物分子或反应的中间态分子中的电子跃迁到激发态，当电子从激发态回复到基态时，以发射光子的形式释放出能量，这一现象称为化学发光。

　　化学发光与荧光的区别是形成激发态分子的激发能不同。荧光是吸收了光能使分子激发而发射的光;而化学发光是吸收了化学能使分子激发而发射的光。

　　通常只有那些反应速度相当快的放能反应，才能在可见光范围内观察到化学发光现象，如氧化-还原反应。二是吸收了化学能而处于激发态的分子或原子，必须能释放出光子。

　　二、化学发光效率

　　又称化学发光反应量子产率。

　　化学发光效率决定于生成激发态产物分子的化学激发效率和激发态分子的发射效率。

　　化学发光反应的发光效率、光辐射的能量大小以及光谱范围，完全由发光物质的性质所决定。

　　第二节　化学发光剂和标记技术

　　一、化学发光剂

　　化学发光剂必须具备下列条件：

　　①发光的量子产率高;

　　②它的物理、化学特性要与被标记或测定的物质相匹配;

　　③能与抗原或抗体形成稳定的偶联结合物;

　　④其化学发光常是氧化反应的结果;

　　⑤在所使用的浓度范围内对生物体没有毒性。

　　(一)直接化学发光剂　在发光免疫分析过程中不需酶的催化作用，直接参与发光反应，可直接标记抗原或抗体。吖啶酯是目前常用的直接标记发光剂。

　　1.吖啶酯：在碱性条件下被H2O2氧化时，发出波长为470nm的光，其激发态产物N-甲基吖啶酮是该发光反应体系的发光体。

　　2.三联吡啶钌：电化学发光剂，和电子供体三丙胺(TPA)在阳电极表面可同时失去一个电子发生氧化反应。

　　(二)酶促反应发光剂　利用标记酶(辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶)的催化作用，使发光剂(底物)发光。辣根过氧化物酶催化的发光剂为鲁米诺及其衍生物;碱性磷酸酶催化的发光底物为AMPPD。

　　二、发光剂的标记技术

　　(一)常用标记方法　小分子物质(如药物、激素等)的标记主要是通过偶联反应制备(直接偶联);生物大分子的标记是利用交联剂使标记物与被标记物分子结构中游离的氨基、硫氢基、羟基等基团形成不可逆的连接(间接偶联)。

　　常见有：碳二亚胺缩合法;过碘酸钠氧化法;重氮盐偶联法;N-羟基琥珀酰亚胺活化法。

　　(二)影响标记的因素

　　1.发光剂的选择。

　　2.被标记蛋白质的性质：选用较高的纯度和免疫学稳定性的抗原进行标记;抗体作为被标记物时，则要求具有较高的效价，应用提纯的IgG来代替全血清。

　　3.选择正确的标记方法。

　　4.原料比：IgG：发光剂：交联剂的克分子比(mol:mol:mol)会影响结合物的发光效率。

　　5.标记率：结合物中IgG与发光剂之间的克分子比。

　　6.温度：尽量选择较低的温度，以避免蛋白质在标记过程中活性的丧失。

　　7.纯化与保存：通过透析法、凝胶过滤法和盐析沉淀法等进行纯化。结合物一般可分装保存在-70℃条件下，最好冷冻干燥保存。

　　第三节　化学发光免疫分析的类型

　　化学发光免疫分析(CLIA)是将化学发光与免疫反应相结合，用于检测微量抗原或抗体的一种标记免疫分析技术。CLIA具有灵敏度高、特异性强、无放射性危害等优点。

　　一、直接化学发光免疫分析

　　化学发光剂(如吖啶酯)直接标记抗体(抗原)，与待测标本形成固相包被抗体-待测抗原-标记抗体复合物，加入氧化剂(H2O2)和pH纠正液(NaOH)，吖啶酯分解、发光，产生的光子能与待测抗原的量成正比。

　　特点：

　　①无需催化剂，只需碱性环境;

　　②加入H2O2和NaOH迅速反应，背景噪声低，敏感性强;

　　③可直接标记，反应稳定;

　　④瞬间发光，持续时间短。

　　二、化学发光酶免疫分析

　　化学发光酶免疫分析(CLEIA)是用参与催化某一化学发光反应的酶如辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(ALP)来标记抗体(或抗原)，与待测标本中相应的抗原(抗体)发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-酶标记抗体复合物，经洗涤后，加入底物(发光剂)，酶催化和分解底物发光。

　　(一)辣根过氧化物酶标记的化学发光免疫分析

　　采用辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体(或抗原)，与反应体系中的待测标本和固相载体发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-酶标记抗体复合物，这时加入鲁米诺发光剂、H2O2和化学发光增强剂使其产生化学发光。

　　(二)碱性磷酸酶标记的化学发光免疫分析

　　以碱性磷酸酶(ALP)标记抗体(或抗原)，反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-酶标记抗体复合物，加入AMPPD发光剂，碱性磷酸酶使AMPPD脱去磷酸根基团而发光。

　　化学发光酶免疫分析的特点：

　　①属酶免疫测定范畴，测定过程与ELISA相似，仅最后一步酶反应的底物改为发光剂和测定的仪器为光信号检测仪;

　　②酶标记抗原或抗体结合稳定;

　　③酶催化鲁米诺、AMPPD等发光剂发出的光稳定，持续时间长，便于记录和测定。

　　三、电化学发光免疫分析

　　电化学发光免疫分析(ECLIA)，磁性微粒为固相载体包被抗体(抗原)，以电化学发光剂三联吡啶钌标记抗体(抗原)，以三丙胺(TPA)为电子供体，在电场中因电子转移而发生特异性化学发光反应。

　　特点：

　　①三联吡啶钌在电场中不断得到三丙胺提供的电子，可持续发光，信号强度高，容易测定，容易控制;

　　②三联吡啶钌直接标记抗原或抗体，结合稳定，不影响被标记物的理化特性;

　　③试剂灵敏度高，稳定性好。

　　四、临床应用

　　由于化学发光免疫测定技术无放射性污染，同时能达到放射免疫测定的灵敏度，而且还具有快速、准确、特异、可自动化等特点，因此已广泛应用于各种激素、肿瘤标志物、药物浓度及其他微量生物活性物质的测定。