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细胞因子与细胞黏附因子的测定

　　细胞因子是由活化的免疫细胞及某些基质细胞表达并分泌的活性物质，其主要生物学功能是介导和调节免疫应答及炎症反应，其化学本质是蛋白质或多肽。

　　细胞黏附分子是介导细胞间及细胞与细胞外基质间黏附作用的分子，其化学本质为糖蛋白，可以细胞膜表面表达和可溶性两种形式存在。

　　二者分别在机体的免疫调节、炎症应答、创伤修复、肿瘤转移等生理和病理过程中发挥重要作用。

　　第一节　生物学测定方法

　　常见的生物学测定法包括：

　　基于DNA检测的分子生物学测定法： 细胞因子或细胞黏附分子DNA扩增法、RNA印迹法、原位杂交法、核酸酶保护分析等，可定性或定量分析细胞因子和细胞黏附分子的基因或mRNA。

　　生物活性测定法： 根据细胞因子特定的生物活性而设计的检测方法，主要用于细胞因子的测定。

　　一、促进细胞增殖和抑制细胞增殖测定法

　　(一)放射性核素掺入法：通过细胞DNA合成的增加或减少来判断细胞增殖的方法。该法的优点是结果客观，可常规用于大标本量的测定， 但方法的特异性受依赖细胞株依赖程度的影响。此外，测定过程中需要使用放射性核素，废物的处理较繁琐。

　　（二）MTT比色法：不使用放射性核素，以细胞代谢变化作为增殖指征来检测细胞因子生物活性的测定方法。

　　二、细胞毒活性测定法

　　待测细胞因子做一系列稀释后加至指示细胞培养体系，以检测培养细胞的死细胞数作为判断指标，死细胞数量与细胞因子的活性成正比。如TNF杀伤肿瘤细胞的测定。

　　三、抗病毒活性测定法

　　抗病毒活性测定法主要用于IFN等细胞因子的检测。

　　四、趋化活性测定法

　　具有趋化活性的细胞因子，也称趋化因子，诸如IL-8、IL-16、PANTES、MCP及MIP等，能诱导中性粒细胞、单核-巨噬细胞或淋巴细胞等定向迁移。其诱导细胞迁移的方式包括趋化性和化学增活性。趋化性是诱导细胞由趋化因子低浓度处向趋化因子高浓度处做定向移动的特性，可采用琼脂糖和Boyden盲端微孔小室趋化试验测定。化学增活性则指细胞因子增强细胞随机运动能力的特性，可采用琼脂糖小滴化学动力学试验测定。

　　某些细胞因子的活性可通过刺激特定细胞分泌的代谢产物而间接反映，据此建立的测定方法，称为细胞因子诱导产物测定法。

　　例如，IL-1可诱导胸腺细胞分泌IL-2，IL-2的水平可间接反映IL-1的活性;细胞因子诱导产物测定法，是目前测定IL-1最常用的方法。

　　五、生物学活性测定方法学评价

　　用于细胞因子生物学活性测定，对细胞因子前体或其降解产物、与可溶性受体结合的细胞因子、细胞因子聚合物等，均不能用此法检测。 细胞因子受体拮抗物、细胞因子的天然抗体和类细胞因子等，也将干扰细胞因子活性的测定。

　　细胞因子生物学活性测定法主要具有以下特点：

　　①敏感性较高；

　　②特异性不高；

　　③操作繁琐；

　　④易受干扰。

　　第二节　免疫测定方法

　　获得针对某一细胞因子的特异性抗体(包括多克隆抗体或单克隆抗体)，采用免疫测定法进行检测。

　　一、ELISA方法

　　ELISA法是细胞因子首选检测法，可作定性或定量分析。双抗体夹心法是用于细胞因子测定的最常用方法， 该法使用的抗体可以是针对同一抗原的多克隆抗体，也可以是针对同一抗原的不同抗原表位的单克隆抗体。

　　细胞因子测定的标本主要包括两大类，一是血清（血浆）、关节液等体液，可用于细胞因子和可溶性黏附分子的检测；二是细胞体外培养后的培养上清液，只用于细胞因子的检测。

　　ELISA法具有特异、简便、易于推广和标准化等优点，可同时检测大量标本且试验废弃物便于处理。此外，无生物学活性的细胞因子前体、分解片段以及与相应受体的结合物也可用此法检测。其缺点是敏感性偏低、不能判断细胞因子的生物学活性。

　　二、流式细胞分析法

　　主要用于细胞内细胞因子和细胞表面黏附分子的检测，通过特异性的荧光抗体染色，能简单、快速地进行检测，精确判断不同细胞亚群的细胞因子和膜分子的表达情况。根据荧光抗体的性质，荧光抗体染色分直接法和间接法。直接法较为常用，其敏感性虽不及间接法，但特异性强。

　　可区分具有不同分泌特性的细胞亚群，如Th1、Th2细胞等。

　　检测细胞内细胞因子时，主要包括以下基本步骤：

　　1.分离和培养待检细胞。

　　2.细胞固定：常用的细胞固定剂为4%多聚甲醛。

　　3.封闭非特异性结合位点：即用含5%脱脂奶粉和钙、镁离子的PBS溶液，重悬已固定的细胞。

　　4.染色与分析：即用荧光素标记的细胞因子特异性单克隆抗体做荧光抗体染色 ，用流式细胞仪分析荧光阳性细胞百分比和荧光强度。此外，若应用不同荧光素标记两种以上细胞因子的单克隆抗体， 则可同时检测同一细胞内2种以上不同的细胞因子。

　　三、酶联免疫斑点试验

　　常用于类风湿因子、IFN-γ等细胞因子分泌细胞的定量测定。

　　在作ELISPOT时，选择的特异性抗体应该具有高亲和力、高特异性、低内毒素的特性。选用的细胞激活物必须不影响细胞的分泌功能。

　　四、免疫学测定方法学评价

　　免疫测定法几乎可以用于所有细胞因子的检测。

　　优点：

　　①特异性高，使用特异的单克隆抗体，可用于单一细胞因子的检测;

　　②操作简便、快速，无需依赖细胞株，故不需维持培养，可操作性增加，容易推广和便于普查;

　　③影响因素相对较少且容易控制，重复性好，方法容易标准化。

　　缺点：

　　①所测定的只是细胞因子的蛋白含量，与其生物活性不一定成正比;

　　②测定结果与所用的抗体来源及亲和力有很大的关系，使用不同来源亲和力的单抗，对同一标本测到的结果可能不同;

　　③敏感性相对较低，比生物活性法约低10～100倍，测定下限一般为100pg；

　　④若标本中存在细胞因子的可溶性受体，可能会影响特异性抗体对细胞因子的结合。

　　第三节　细胞因子与细胞黏附分子测定的临床应用

　　细胞因子的测定主要用于以下几方面：

　　①特定疾病的辅助诊断;

　　②机体免疫状态的评估;

　　③临床疾病治疗效果的监测和指导用药;

　　④疾病预防的应用。

　　一、临床应用原则

　　细胞因子和黏附分子具有：异质性、功能交叉性和多样性、来源的复杂性和组织细胞的非特异性，故在临床检测中，要求：

　　1.方法的联合应用

　　2.标本的适当选取

　　3.细胞因子的联合检测

　　二、特定疾病诊断的辅助指标

　　三、评估机体的免疫状态、判断治疗效果及预后

　　机体免疫状态与疾病的发生发展和预后密切相关，机体免疫应答的强弱，可通过细胞因子或黏附分子的表达水平来反映。

　　此外，通过人为调整患者体内的细胞因子水平可达治疗目的，人工重组细胞因子已在临床疾病的治疗方面发挥了重要作用。