【含金量最高】2018-【公卫执业医师】生物化学【考点解读】-第10章

2018年01月25日 来源:来学网

第十章 DNA的生物合成

  生物体的遗传信息储存在DNA中,并通过DNA的复制由亲代传给子代。在子代的生长发育中遗传信息自DNA转录给RNA,然后翻译成蛋白质以执行各种生命功能,使后代表现出与亲代相似的遗传性状。

  1958年,F.Crick提出中心法则:

  (1)以原DNA分子为模板,合成出相同DNA分子的过程。

  (2)以某一段DNA分子为模板,合成出与其序列对应的RNA分子的过程。

  (3)以mRNA为模板,根据三联密码规则,合成对应蛋白质的过程。

  中心法则揭示了生物体内遗传信息的传递方向。(实际上10、11、12这三章分别讲述了中心法则的三个主要环节)

  DNA生物合成有两种方式:DNA复制和反转录

  DNA体内复制涉及:原核、真核生物的染色体、细菌质粒(环状,双链)、真核细胞器DNA(线粒体、叶绿体)、病毒(双链,环状)

  DNA的体外复制:分子克隆。

  一、DNA的复制

  1、 DNA半保留复制

  在复制过程中,首先亲代双链解开,然后每条链作为模板,在其上合成互补的子代链,结果新形成的两个子代DNA与亲代DNA分子的碱基顺序完全一样,而且每个子代DNA分子中有一条链完全来自亲代DNA,另一条是新合成的。

  1958年,Meselson和Stahl用15N标记E.coli. DNA,然后密度梯度离心,证明了DNA的复制是半保留复制。

  1963年,Cairns用放射自显影法,在显微镜下首次观察到完整的正在复制的E. coli. 染色体DNA。用3H-脱氧胸苷标记E.coli. DNA ,经过将近两代时间,用溶菌酶消化细胞壁,将E.coli. DNA转至膜上,干燥,压感光胶片,3H放出β粒子,还原银,在光学显微镜下观察。用这种方法证明了大肠杆菌染色体DNA是一个环状分子,并以半保留的形式进行复制。

  DNA的半保留复制可以说明DNA在代谢上的稳定性。经过多代复制,DNA的多核苷酸链仍可以保持完整,并存在于后代而不被分解掉。

  二、 复制起点、单位和方向

  DNA的复制是在起始阶段进行控制的,一旦复制起始,它就会继续下去直到整个复制子完成复制。

  1、 复制起点

  复制起点是以一条链为模板起始DNA合成的一段序列。有时,两条链的复制起点并不总是在同一点上(如D环复制)。 在一个完整的细胞周期中,每一个复制起点只使用一次,完成一次复制过程。多数生物的复制起点,都是DNA呼吸作用强烈(甲醛变性实验)的区段,即经常开放的区段,富含A.T。

  2、 复制单位

  复制子(Replicon):Genome能独立进行复制的单位,每个复制子都含有一个复制起点。

  原核生物的染色体和质粒、真核生物的细胞器DNA都是环状双链分子,它们都是单复制子,都在一个固定的起点开始复制,复制方向大多数是双向的,少数是单向复制。多数是对称复制,少数是不对称复制(一条链复制后才进行另一条链的复制)。

  环状DNA的复制眼象θ,称θ形复制。

  真核生物的染色体DNA是线形双链分子,含有许多复制起点,因此是多复制子,每个复制子约有100-200Kbp。人体细胞平均每个染色体含有1000个复制子。

  病毒DNA多种多样,环状或线形,双链或单链,但都是单复制子。

  3、 复制方向

  定点起始,复制方向大多数是双向的(等速进行或异速进行),形成两个复制叉,少数是单向复制,形成一个复制叉。

  4、 DNA的几种复制方式

  (1)、 直线双向复制

  单点,双向,T7

  多点,双向,真核染色体DNA

  (2)、 θ型复制:环状双链DNA,单向或双向(E .coli.)

  (3)、 滚环复制:环状单链DNA,Φx174

  (4)、 D环复制:线粒体、叶绿体DNA

  (5)、 多复制叉复制:

  第一轮复制尚未完成,复制起点就开始第二轮的复制。

  在E.coli.富营养时,可采取多复制叉复制方式。E.coli. DNA的复制最快可达50Kb/min,完全复制需40min,富营养时,20min分裂。而真核染色体要6-8小时。

  三、 与DNA复制有关的酶及蛋白质因子

  目前已发现30多种酶及蛋白质因子参与DNA复制

  (一) DNA的聚合反应和聚合酶

  DNA生物合成5,→3,,化学合成3,→5,

  1、 DNA聚合反应必备的条件

  ⑴ DNA聚合酶

  ⑵ DNA模板(反转录时用RNA模板)

  ⑶引物 (DNA、RNA或蛋白质)

  ⑷ 4种dNTP

  ⑸ Mg2+

  2、 聚合反应过程及特点

  总反应式:

  n1dATP DNA pol . dAMP

n2dGTP +DNA dGMP DNA+(n1+n2+n3+n4)PPi

  n3dCTP Mg2+ dCMP

  n4dTTP dTMP

  在链的延长过程中,链的游离3,-羟基,对进入的脱氧核糖核苷三磷酸α磷原子发生亲核攻击,生成3,.5,-磷酸二酯键,并脱下焦磷酸。

  DNA聚合酶的反应特点:

  ⑴ 以4种dNTP为底物

  ⑵ 反应需要接受模板的指导,不能催化游离的dNTP的聚合。

  ⑶ 反应需有引物3,-羟基存在

  ⑷ 链生长方向5, → 3,

  ⑸ 产物DNA的性质与模板相同

  3、 由DNA聚合酶催化的几种DNA聚合类型

  (1) 发荚环结构:加入单链DNA作为模板和引物,3'羟基端回折成引物链。

  (2) 末端延伸聚合:加入双链DNA作为模板和引物,3’末端突出作为模板。

  (3) 分枝型和切口平移型聚合:加入双链DNA,聚合发生在切口或末端单链区。

  (4) 环形聚合:加入带引物的环形DNA作为模板。

  4、 E.coli DNA聚合酶

  (1)、 E.coli. DNA pol.I(Kornberg酶,400 copy/cell)

  单体酶,分子量109Kd,含一个Zn2+,每个细胞中含400个DNA pol.Ⅰ

  催化活性:

  5, → 3, 聚合活性

  3, → 5, 外切活性

  5, → 3, 外切活性

  用蛋白水解酶将DNA pol.Ⅰ部分水解可得:

  大片段(Klenow),75Kd,活性:5, → 3,聚合活性、3, → 5,外切活性。

  小片段,36Kd,活性:5, → 3,外切活性(只作用于双链DNA的碱基配对部分,切除修复)。

  Klenow片段的用途:

  a 补齐DNA 3,隐缩未端

  b. 标记DNA片段未端

  c.cDNA合成第二链

  d.d DNA测序

  (2)、 E.coli. DNA Pol.Ⅱ(100 copy/cell)

  单体酶,分子量120Kd

  催化活性:5,→ 3,聚合(活性很低)

  3,→ 5,外切

  可能在DNA的修复中起某中作用。

  (3)、 E.coli.DNA pol.Ⅲ(复制酶,10-20 copy/cell)

  寡聚酶,全酶由10种共22个亚基组成,α、ε和θ三种亚基组成核心酶。

  DNA pol.Ⅲ是合成新链DNA主要的酶,又称复制酶(Replicase)

  Pol.Ⅲ的5,→3,外切酶活性只作用于单链DNA。

  ★DNA聚合酶有6个结合位点

  ⑴ 模板DNA结合位点

  ⑵ 引物结合位点

  ⑶ 引物3,-OH位点、反应位点

  ⑷ 底物dNTP结合位点

  ⑸ 5, → 3, 外切位点(pol.Ⅱ没有)

  ⑹ 3, → 5, 外切位点(校正)

  5、 真核生物DNA聚合酶

  真核DNA聚合酶一般不具备外切活力,可能由另外的酶在DNA复制中起校正功能。

  ⑴ DNA聚合酶α,多亚基,功能与E.coli. pol.Ⅲ类似,是真核DNA复制酶。

  ⑵ DNA聚合酶β,主要在DNA损伤的修复中起作用。

  ⑶ DNA聚合酶γ,从线粒体得到,可能与线粒体DNA的复制有关。

  ⑷ DNA聚合酶δ,特点:有3, → 5,外切活力

  (二) 引物酶或RNA聚合酶(引发酶)

  细胞内,DNA的复制需要引物(DNA或RNA),引物酶或RNA聚合酶可合成6-10个碱基的RNA引物。

  ★DNA复制为什么要用RNA引物?(为什么DNA聚合酶要用引物,RNA聚合酶不需要引物?)

  ⑴从模板复制最初几个核酸时,碱基堆集力和氢键都较弱,易发生错配

  ⑵新复制的最初几个核苷酸,没有与模板形成稳定双链,DNA聚合酶的5,→3,校对功能难发挥作用。

 

(三) 解螺旋酶

  大肠杆菌的解螺旋酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ与rep蛋白共同作用,将DNA两条链解开。

  解螺旋酶I、II、III沿着模板链的5’→3’方向随着复制叉的前进而移动,而rep蛋白则在另一条模板链上沿3’→5’方向移动。

  (四) DNA旋转酶

  属DNA拓扑异构酶Ⅱ,可引入负超螺旋,消除复制叉前进时带来的扭曲张力。

  拓扑异构酶分两类:I和II,广泛存在于原核生物和真核生物。

  拓扑异构酶I使DNA的一条链发生断裂和再连接,反应无须供给能量,主要集中在活性转录区,与转录有关。

  拓扑异构酶Ⅱ使DNA的两条链同时断裂和再连接,当它引入超螺旋时需要由ATP供给能量。分布在染色质骨架蛋白和核基质部,与复制有关。

  (五) 单链DNA结合蛋白(SSB)

  复制叉上的解螺旋酶,沿双链DNA前进,产生单链区,大量的单链DNA结合蛋白与单链区结合,阻止复性和保护单链DNA不被核酸酶降解。

  (六) DNA连接酶(ligase)

  连接双链DNA上的切口。

  大肠杆菌连接酶只能在模板上连接DNA缺口。T4DNA ligase即可连接粘性末端的DNA,又可连接平齐末端的双链DNA。

  E.coli.和其它细菌的DNA ligase以NAD为能源,动物细胞和噬菌体DNA ligase以ATP为能源。

  (七) DNA复制的拓扑结构

  四、 DNA的半不连续复制

  DNA的半不连续复制

  DNA聚合酶催化的方向是5,→3,。

  前导链:延伸方向与复制叉移动方向相同的子代DNA链。

  滞后链:延伸方向与复制叉移动方向相反的子代DNA链。

  1968年,发现冈崎片段。长度:

  细菌:1Kb-2Kb,相当于一个顺反子的大小。

  真核:100-200bp,约等于一个核小体DNA的长度。

  五、 DNA复制过程(E.coli.)

  大肠杆菌的复制体结构示意图

  1、 复制的起始

  引发:当DNA的双螺旋解开后,合成RNA引物的过程。

  引发体:引物合成酶与各种蛋白质因子(dnaB、dnaC、n、n'n''I)构成的复合体,负责RNA引物的合成。

  引发体沿着模板链5’→3’方向移动(与冈崎片段合成的方向正好相反,而与复制叉移动的方向相同),移到一定位置上即可引发RNA引物的合成。

  E.coli.DNA复制原点ori C,由245bp组成,三组13bp重复序列(近5,端处),四组9 bp重复序列(另一端处)。

  大肠杆菌复制原点起始复制所需蛋白质:

  DNaA 在原点处打开双螺旋

  DNaB 使DNA解旋

  DNaC DNaB结合在原点所需

  Hu 刺激起始

  引物酶(DNaG) 合成RNA引物

  SSB 结合单链DNA

  RNA聚合酶 促进DNaA活性

  旋转酶 松驰DNA扭曲应力

  20个DnaA结合在四组9bp重复区,形成起始复合物,DNA环绕此复合物。

  三组13bp重复区依次变性,产生开放型复合物。

  DnaB(在DnaC协助下)与开放复合物结合,进一步解链。

  2、 DNA链的延长反应

  前导链只需要一个RNA引物,后随链的每一个冈崎片段都需要一个RNA引物,链的延长反应由DNA pol.Ⅲ催化。

  复制体:在DNA合成的生长点(既复制叉上)分布着许多与复制有关的酶和辅助因子,它们在DNA的模板链形成离散的复合物,彼此配合进行高度精确的复制,称为复制体。

  复制体沿着复制叉方向前进就合成DNA。

  3、 RNA引物的切除及缺口补齐

  DNA polⅠ的5, → 3,外切活力,切除RNA引物。

  DNApolⅠ的5, → 3,合成活性补齐缺口。

  4、 DNA切口的连接

  DNA ligase,动物、真核由ATP供能,原核由NAD供能。

  5、 DNA合成的终止

  环状DNA、线性DNA,复制叉相遇即终止。

  u 小结:

  ⑴ DNA解螺旋酶解开双链DNA。

  ⑵ SSB结合于DNA单链。

  ⑶ DNA旋转酶引入负超螺旋,消除复制叉前进时带来的扭曲张力。

  ⑷ DNA引物酶(在引发体中)合成RNA引物。

  ⑸ DNA pol.Ⅲ在两条新生链上合成DNA。

  ⑹ DNA polⅠ切除RNA引物,并补上DNA。

  ⑺ DNA ligase连接一个冈崎片段。

  DNA复制过程中,聚合酶对dTTP和dUTP的分辨能力高,有少量dUTP掺入DNA链中,此时,U-糖苷酶、AP内切酶、DNA polⅠ、DNA ligase共同作用,切除尿嘧啶,接上正确的碱基。

  六、 真核生物DNA的复制

  1、 复制起点和单位

  真核生物染色体DNA是多复制子,有多个复制起点,可以多点起始,分段进行复制。每个复制子大多在100-200bp之间,比细菌染色体DNA(单复制子)小得多。

  ★试验证据:5-氟脱氧胞苷标记

  真核生物DNA复制叉移动的速度此原核的慢,如哺乳动物复制叉移动的速度每分钟1-3Kb,细菌每分钟5Kb。

  真核生物染色体全部复制完成前,起点不再从新开始复制。而在快速生长的原核生物中,起点可以连续发动复制。真核生物在快速生长时,可采用更多的复制起点同时复制。如黑腹果蝇,早期胚胎细胞中相邻复制起点的平均距离为7.9kb,而在培养的成体细胞中,平均距离为40kb,成体细胞只利用一部分复制起点。

  2、 复制过程中组蛋白的装配

  核小体的结构(200bp左右)

  在真核生物的复制子上,亲代染色体的核小体被逐个打开,组蛋白以完整的八聚体形式直接转移到子代DNA的前导链上,新合成的组蛋白与后随链组装成核小体。因此,DNA的复制是半保留的,而组蛋白则是全保留的。

  3、 真核生物DNA复制的终止

  端粒:一段DNA序列与蛋白质形成的一种复合体,是真核细胞染色体末端所特有的结构。

  功能:

  ⑴保证线性DNA的完整复制

  ⑵保护染色体末端

  ⑶决定细胞寿命,胚系细胞含端粒酶,体细胞不表达端粒酶。

  端粒(telomeres)分布于线性真核染色体未端。酵母端粒约100bp的重复序列,形式为:5,(TxGy)n3,(AxCy) n,x和y一般为1—4。

  端粒末端的重复序列,通过端粒酶(telomerase)将其加到染色体末端。

  端粒酶含有RNA和蛋白质(起DNA聚合酶的作用)两种组分,RNA分子约159b,含有多个CyAx重复序列,RNA分子用作端粒TxGy链合成的模板。端粒酶是一种反转录酶,它只合成与酶自身的RNA模板互补的DNA片段。

  人类体细胞的端粒长度,随个体年龄增加而逐渐缩短。细胞每分裂一次,端粒缩短50-200bp,短至1-4Kbp时,细胞就停止分裂。若能重建端粒,则细胞可以永远分裂。恶性肿瘤细胞端酶表达多。

  七、 DNA复制的调控

  八、 DNA复制的真实性

  生物体DNA复制具有高度真实性,复制10-7-10-11碱基对,只有一个错误碱基。碱基对的自由能通常在4-13KJ/mol,这样的自由能相当于平均参入100个核苷酸就可能出现一次错配,仅靠Watson-Crick双螺旋的碱基配对原则,突变率将高达10-2 。

  1、 DNA聚合酶对碱基的选择作用

  酶的被动论:不同的核苷酸在聚合位点停留时间不同,正确的dNTP能长时间停留,而参与聚合。DNA聚合酶能依照模板的核苷酸,选择正确的dNTP掺入引物末端。

  酶积极参与理论:DNA聚合酶对正确与错误的核苷酸,不仅亲和性不同,而且将它们插入DNA引物端的速度也不同。

  动力学校正阅读:在新的磷酸二酯键未形成时,dNTP结合在酶与模板—引物复合物的聚合位点上,DNA聚合酶能识别正确与错误的dNTP。

  DNA聚合酶对底物的识别作用,DNA聚合酶有两种底物,一种是DNA模板—引物,另一种是dNTP。

  DNA聚合酶先识别DNA模板和引物的3,未端,再识别底物dNTP,是一种有序的识别过程。

  2、 3,→5,外切活性的校正阅读

  E. coli. DNA pol.Ⅰ和pol.Ⅲ有3,→5,外切活性,可删除错误插入的核苷酸。

  缺失3, →5,外切活性的E. coli. DNA pol.Ⅰ,催化DNA合成时,出现错误的几率增高5-50倍。因此,3,→5,外切活性可以使DNA复制的真实性,提高1-2个数量级。

  3、 影响DNA合成真实性的因素

  ⑴高浓度NMP(如3,-AMP, 5,-GMP)

  NMP竞争酶的dNTP结合位点,抑制3,→5,外切活性。

  ⑵某一种dNTP浓度银高,可使引物3,末端离开外切活性中心。

  ⑶dNTP 一般与二价阳离子结合成活化形式,Mg2+为主要的二价阳离子。当用其它二价阳离子(如Mn2+)代替Mg2+时,会改变酶的主体结构,影响聚合活性和3,→3,外切活性。

  4、 为什么用RNA引物

  ⑴从模板复制最初几个核酸时,碱基堆集力和氢键都较弱,易发生错配

  ⑵新复制的最初几个核苷酸,没有与模板形成稳定双链,DNA聚合酶的5,→3,校对功能难发挥作用。

  DNA的损伤及修复

  DNA的损伤:一些物理化学因子如紫外线、电离辐射和化学诱变剂均可引起DNA损伤,破坏其结构与功能。然而在一定条件下,生物机体能使这种损伤得到修复。紫外线可使DNA分子中同一条链上两个相邻的胸腺嘧啶碱基之间形成二聚体(TT),两个T以共价键形成环丁烷结构。CT、CC间也可形成少量二聚体(CT、CC),使复制、转录受阻。

  细胞内具有一系列起修复作用的酶系统,可以除去DNA上的损伤,恢复DNA的双螺旋结构。目前已知有4种酶修复系统:光复活、切除修复、重组修复、SOS反应诱导的修复,后三种不需要光,又称为暗修复。

  一、 直接修复

  1949年已发现光复活现象,可见光(最有效400nm)可激活光复活酶,此酶能分解由于紫外线形成的嘧啶二聚体。高等哺乳动物没有此酶。

  A 形成嘧啶二聚体 B. 光复合酶结合于损伤部位 C 酶被可见光激活 D. 修复后释放酶

  二、 切除修复

  在一系列酶的作用下,将DNA分子中受损伤部分切除,并以完整的那一条链为模板,合成出切去部分,DNA恢复正常结构。

  I、结构缺陷的修复:

  (1)核酸内切酶识别DNA损伤部位,在其附近将其切开。

  (2)核酸外切酶切除损伤的DNA。

  (3)DNA聚合酶修复。

  (4)DNA连接酶连接。

  切除修复发生在DNA复制之前,而当DNA发动复制时尚未修复的损伤部位,可以先复制,再重组修复。

  在重组修复过程中,DNA链的损伤并未除去,但相当于被稀释了。因为受损伤的链没有增加。

  四、 易错修复和应急反应(SOS反应)

  诱导修复是细胞DNA受到严重损伤或DNA复制系统受到抑制的紧急情况下,为求得生存而出现的一系列诱导性修复。SOS反应广泛存在于原核生物和真核生物,它是生物在极为不利的环境中求得生存的一种基本功能。

  RNA指导的DNA合成(反转录)

  反转录(reverse transcription):以RNA为模板,合成DNA。与通常转录过程中遗传信息流从DNA到RNA的方向相反。

  1970年,Temin 和Baltimore分别从致癌RNA病毒(劳氏肉瘤病毒和鼠白血病病毒)中发现发反转录酶。致癌RNA病毒是一大类能引起鸟类、哺乳类等动物白血病、肉瘤以及其它肿瘤的病毒。这类病毒侵染细胞后并不引起细胞死亡,却可以使细胞发生恶性转化。经过改造后可以作为基因治疗的载体。

  放线菌素D(抑制以DNA为模板的反应,复制和转录)能抑制致癌RNA病毒的复制,可见致癌RNA病毒的复制过程必然涉及DNA。Bader 用嘌呤霉素(puromycin)来抑制静止细胞蛋白质的合成,发现这种细胞仍能感染劳氏肉瘤病毒(RSV),证实反转录酶是由反转录病毒带入细胞的,而不是感染后在宿主细胞中新合成的。

  一、 反转录酶

  由一个α亚基和一个β亚基组成,含有Zn2+,具有三种酶活力。

  (1)RNA指导的DNA聚合酶活力(以RNA为模板,合成一条互补的DNA,形成RNA—DNA杂种分子)。

  (2)RNase H酶活力,水解RNA—DNA杂种分子中的RNA,可沿3’→5’和5’→3’两个方向起外切酶作用。

  (3)DNA指导的DNA聚合酶活力。

  模板:RNA或DNA

  以自身病毒类型的RNA为模板时,该酶的反转录活力最大,但是带有适当引物的任何种类的RNA都能作为合成DNA的模板。

  引物:RNA或DNA

  底物:dNTP

  二价阳离子:Mg2+或Mn2+

  真核mRNA3’端有polyA,加入oligo dT后,可以作为反转录酶的模板,合成cDNA。

  二、 病毒RNA的反转录过程

  所有已知的致癌RNA病毒都含有反转录酶,因此被称为反转录病毒(retrovirus),反转录病毒的复制需要经过一个DNA中间体(前病毒)。

  1、 反转录病毒的基因组结构

  (1) 反转录病毒基因组通常由两条相同的(+)RNA链组成。5’端附近区域以氢键结合在一起,全长7-10Kb。

  (2) 每一条RNA链的两端具有相同的序列,形成正向重复序列。

  (3) 5’端有帽子结构,3’端有polyA,与真核mRNA相似。

  (4) 5’端带有1分子的宿主tRNA,作为反转录时的引物。某些鸟类反转录病毒携带的是tRNAtrp,鼠类是tRNApro

  2、 反转录过程。

  当致癌RNA病毒侵染宿主细胞时,病毒RNA及反转录酶一起进入宿主细胞,病毒自身带入的反转录酶使RNA反转录成双链DNA。

  (1) 以病毒(+)RNA为模板,合成互补的(-)DNA。

  (2) 切除RNA—DNA杂种分子中的RNA。

  (3) 以(-)DNA链为模板,合成(+)DNA链,最后形成两端带有LTR(长末端重复序列)的双链DNA。

  反转录病毒只有整合到宿主染色体DNA后才能被转录,转录产物经拼接可以产生不同的病毒mRNA。LTR(长末端重复序列)对前病毒DNA整合到宿主染色体DNA以及整合后的转录均起着重要作用。

  反转录病毒合成的过程:缺口的模板(基因组)RNA,在U3旁生成一个正链DNA的合成RNA的引物,而其余的模板RNA被降解。正链DNA合成开始,复制。

  3、 反转录病毒的生活周期

  (1) 病毒粒子侵染细胞,病毒RNA和反转录酶一起进入细胞。

  (2) RNA被反转录成双链DNA(前病毒),环化,进入细胞核。

  (3) 反转录病毒的DNA整合到宿主染色体DNA中。

  (4) 前病毒DNA进行复制,转录出功能基因、基因组RNA和病毒蛋白。

  (5) 基因组RNA和病毒蛋白在胞质中组装成新病毒粒子,转移到质膜,通过出芽方式释放新病毒粒子。

  三、 反转录的生物学意义。

  1.反转录酶存在于所有致癌RNA病毒中,它的存在与RNA病毒引起细胞恶性转化有关。

  2.艾滋病毒(AIDS)

  人类免疫缺陷病毒(HIV),也是一种反转录病毒,主要感染T4淋巴细胞和B淋巴细胞。病毒粒子直径100nm,球状,粒子外包被两层脂质质膜,膜上有糖蛋白(gp120、gp41),另有两层衣壳蛋白p24、p18。

  HIV基因组由两条单链正链RNA组成,每个链长9.7kb,RNA 5,端有帽子结构,3’端有PolyA,链上结合有反转录酶。

  3.乙肝病毒

  大蛋白、中蛋白、主蛋白(表面抗原)

  核心抗原

  双链环状DNA

  4、真核生物正常细胞内也存在反转录过程

  真核生物的谈色体基因组中存在为数众多的逆假基因和逆基因。

  逆假基因:无启动子和内含子,但有polyA的残基,推测是由mRNA反转录后整合到基因组中去的。

  逆基因:具有启动子和转录功能,无内含子。可能是由于mRNA反转录后刚好整合到启动子的下游处,或者是带启动子的RNA序列反转录后整合到基因组中

  DNA合成技术

  一、 cDNA合成

  1、 cDNA文库的构建

  cDNA:以mRNA为模板,用反转录酶合成第一链,去除mRNA,合成的第二链。

  cDNA文库是获得真核结构基因的最好方法,成熟的mRNA无内含子。

  (1)、 真核mRNA的分离纯化

  (2)、 cDNA合成(反转录酶)

  (3)、 cDNA与载体连接

  (4)、 重组体的转化

  (5)、 扩增、保存

  2、 获取特定mRNA的cDNA

  (1)免疫法分离特定的mRNA

  (2)PCR法

  二、 PCR技术(聚合酶链式反应)Polymerase chain Reaction

  以目的基因或DNA片段为模板,在引物介导及Taq DNA聚合酶催化下,在体外用核苷酸大量合成目的基因或DNA片段。

  它能快速、专一地扩增所希望得到的目的基因或DNA片段。

  1、 反应物

  (1)模板

  单、双链DNA或cDNA都可以作为PCR的模板,若以RNA为起始材料,则须经反转录,获得第一条cDNA后才能用于PCR。

  (2)Taq DNA聚合酶

  DNA聚合酶是进行PCR扩增的关键,从水生栖热菌(Thermus aquaticns VT-1)分离出来。

  Taq DNA聚合酶有很好的热稳定性,92.5℃处理130min,仍保留50%的酶活性,在74℃活性最高,错误掺入核苷酸的比率为1/7500。

  (3)引物

  引物是决定PCR结果的关键,它由寡核苷酸组成,15-30个b

  (4)核苷酸dNTP

  dNTP的浓度50-200umul/L。

  (5)镁离子Mg2+

  2、 PCR原理

  变性 95℃

  复性 55℃

  延伸 72℃

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