皮质醇测定可用荧光法、毛细管电泳法、高相液相色谱、气相色谱、液(气)-质联用及免疫法。其中荧光法灵敏度低并易受干扰现已淘汰；毛细管电泳法、高相液相色谱、气相色谱、液(气)-质联用等需对样本进行复杂的预处理和特殊仪器，难以推广。现在临床实验室几乎均用免疫法检测皮质醇，试剂盒都使用以保留其抗原性的皮质醇衍生物-蛋白复合物免疫动物制备抗体，故检测的是总皮质醇浓度。