胰蛋白酶原本身没有活性，在小肠中通过肠致活酶（肠激酶）的作用，转变为有活性的胰蛋白酶。胰蛋白酶本身（正反馈调节）、胃酸、组织液也可激活胰蛋白酶原为胰蛋白酶，但相对肠激酶来说，作用比较次要。糜蛋白酶对胰蛋白酶原无激活作用（但胰蛋白酶可激活糜蛋白酶原)。